Эффективная экспрессия и очистка рекомбинантного белка MUTYH в Escherichia coli

Аннотация

MUTYH – это ДНК-гликозилаза, участвующая в процессе эксцизионной репарации оснований (BER), ответственная за распознавание и удаление аденина, неправильно соединенного с 8-оксогуанином. Патогенные варианты или нарушение функции MUTYH связаны с полипозом, ассоциированным с MUTYH, и повышенным риском развития колоректального рака. Рекомбинантная продукция MUTYH необходима для биохимических и структурных исследований.В этом исследовании мы разработали и оптимизировали протокол экспрессии и очистки рекомбинантного белка MUTYH человека, слитого с N-концевой меткой 6×His. Конструкции дикого типа были клонированы в экспрессирующий вектор pET-28c и экспрессированы в штаммах Escherichia coli Rosetta (DE3), ArcticExpress(DE3) и SHuffle® T7 Express. Низкотемпературная индукция и оптимизированные концентрации IPTG улучшили растворимость белка. Рекомбинантный MUTYH очищали с помощью Ni^2⁺ - аффинной хроматографии с последующей аффинной хроматографией с гепарином. Анализы SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга подтвердили высокий уровень экспрессии и эффективное выделение рекомбинантного белка, при этом значительная часть была выделена в растворимой форме. Оптимизированный рабочий процесс обеспечивает воспроизводимый метод получения очищенного MUTYH, пригодного для последующих биохимических и структурных исследований. В будущем мы планируем оценить его ферментативную активность.