Электрофизиологический анализ пуринергической сигнализации микроглии как подход к изучению иммунных механизмов болезни Альцгеймера

Аннотация

Нейровоспаление, опосредованное хронической активацией микроглии, рассматривается как один из ведущих факторов патогенеза болезни Альцгеймера (БА). Ключевую роль в модуляции функционального состояния микроглии играет пуринергическая сигнализация, в частности рецепторы P2X4 и P2X7, активируемые внеклеточным АТФ. Понимание ионных механизмов, запускаемых этими рецепторами, необходимо для поиска новых терапевтических мишеней, однако исследование их функциональной активности требует применения высокоточных электрофизиологических методов. В  работе проведено изучение АТФ-индуцированных ионных механизмов в клетках микроглии линии BV-2 с целью углубления понимания роли пуринергической сигнализации микроглии в нейровоспалении и нейродегенеративных заболеваниях, включая БА. Исследование выполнено на иммортализированной линии микроглии мыши BV-2 и клеточной линии HEK293 (Human Embrionic Kidney 293 использовалась для оптимизации параметров регистрации). Электрофизиологические измерения проводились в конфигурации «целая клетка» (whole-cell) при удерживающем потенциале –60 мВ. Активация пуринорецепторов осуществлялась путем локальной аппликации АТФ (1 мМ). В ходе исследования  отработаны условия формирования стабильного гигаомного контакта и перехода в конфигурацию whole-cell для клеток с амёбоидной морфологией. Установлено, что аппликация АТФ вызывает во всех исследованных клетках линии BV-2 (n=10) выраженные входящие токи со средней амплитудой 188 ± 33 пА. Зарегистрированные ответы характеризовались медленной кинетикой развития и отсутствием быстрой десенситизации на протяжении всего периода воздействия агониста. В отличие от первичных культур человека, в клетках BV-2 не выявлено классической двухфазной кинетики, характерной для полномасштабного открытия поры P2X7-рецептора. Это может указывать на превалирование подтипа P2X4 или на особенности регуляции пуринорецепторов в иммортализированных линиях. Полученные результаты подтверждают высокую эффективность метода patch-clamp для оценки функционального состояния микроглии. Выявленные особенности АТФ-индуцированных токов в клетках BV-2 позволяют использовать данную линию как адекватную модель для первичного скрининга модуляторов пуринергической сигнализации.