CRISPR/Cas12a-RPA интегрированный метод для потенциала быстрой детекции Fusarium spp.

Аннотация

Своевременное обнаружение и точная идентификация возбудителей болезней сельскохозяйственных культур являются ключевыми элементами устойчивых агросистем, обеспечивающими оперативное и эффективное управление защитой растений. Современная технология CRISPR/Cas12a активно развивается как платформа на основе нуклеиновых кислот с высоким потенциалом для быстрого, чувствительного и специфичного выявления фитопатогенов. В данной работе разработан метод на основе CRISPR/Cas12a для детекции грибов рода Fusarium, нацеленный на ген acl1. Плазмида, содержащая фрагмент целевого гена, была успешно амплифицирована с использованием метода Рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA), что подтвердило возможность интеграции этой изотермической амплификации с методом детекции CRISPR/Cas12a. Оптимизация реакции CRISPR-Cas12a показала, что наилучшие условия достигаются при концентрациях 100 нМ MbCas12a, 100 нМ crRNA и 5 µМ ssDNA-репортера. Тесты чувствительности показали надёжное выявление гена acl1 при разведении до 1:1000. Оценка специфичности с участием различных фитопатогенных грибов подтвердила высокую селективность разработанного метода. В целом результаты исследования демонстрируют потенциал системы на основе CRISPR/Cas12a как перспективного диагностического инструмента для выявления грибов рода Fusarium в сельскохозяйственных применениях.